大鼠肝卵圆细胞的诱导增生、分离、体外培养和性质鉴定
作者：薛玲 文剑明 吴惠茜 张萌 董郡
单位：510089 广州，中山医科大学病理学教研室
关键词：
中华病理学杂志980227 卵圆细胞(oval cell)是肝内的干细胞，在原发性肝癌的发生中可能具有特殊作用，故分离并体外培养之，使之成为细胞癌变多步骤发生发展的体外模型，对研究肝癌的组织起源具有重要意义。
一、材料与方法
1.卵圆细胞增生动物模型的建立：由我校实验动物中心提供标准SD大鼠，体重100～120 g，饲养1周后，改喂含有0.06%3′-甲基-二甲胺基偶氮苯(3′-Me-DAB，东京化成工业株式会社)的饲料，4周后大鼠肝内可见大量卵圆细胞增生(由HE切片证实)。
2.卵圆细胞的分离：取饲喂含3′-Me-DAB饲料4周的大鼠，麻醉后剪开腹壁，结扎肝动脉，插管于门静脉，用无钙镁磷酸缓冲液灌注大鼠肝(循环泵的灌注速度为20 ml/分钟)至苍白色后，改用0.1% Ⅳ型胶原酶(Sigma公司产品)继续灌注。10分钟后，将肝脏剪碎，置0.06%Ⅳ型胶原酶溶液中，37℃振荡消化30分钟，过滤，4℃ 2 000 r/min离心10分钟，倾去上清液，用F12培养液悬浮细胞。将Percoll(Pharmacia公司产品)配成50%、70%、90%的梯度离心液，从离心管底部开始逐层铺加，细胞悬液置于最上层，4℃ 12 000 r/min离心30分钟。小心吸取卵圆细胞层(位于50%和70%的Percoll层之间)，用Hanks液洗细胞两次后离心，将细胞团悬浮于培养液中，接种于塑料培养瓶(Corning公司)，在37℃、5% CO2孵箱中培养，第二天可见卵圆细胞在瓶底贴壁生长。
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3.卵圆细胞的培养：培养液参照Germain[1]的方法配制。培养基为DMEM/F12(1∶1)和20%小牛血清，加入表皮生长因子、转铁蛋白及多种氨基酸(Sigma公司)。将卵圆细胞进行常规培养，每2天换液一次，细胞长满后传代。
4.卵圆细胞性质的鉴定：(1)细胞大小的测定及HE形态观察。(2)免疫组化：用Cytospin仪将细胞涂于载玻片上，冷丙酮固定，免疫组化检测采用LSAB法。检测抗体有：细胞角蛋白8(1∶100)，细胞角蛋白19(1∶100)，白细胞共同抗原(LCA，1∶100)，波形蛋白(1∶100)，甲胎蛋白(AFP)(1∶200)，均为DAKO 公司产品。(3)透射电镜：收集培养细胞，于4℃下用多聚甲醛-戊二醛(pH 7.3)固定4小时，锇酸固定1小时，系列酒精及丙酮脱水，Epon 812渗透包埋，超薄切片；醋酸双氢铀及枸橼酸铅双重染色。H-600型电镜75 KV观察拍片。(4)γ-谷氨酰转肽酶(γ-GT)组织化学：将细胞接种于玻片上，待细胞贴壁后用冷丙酮固定。以V-L-谷氨酰-2-萘胺作底物，六偶氮副品红作偶联剂，以正常肾组织作阳性对照。
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二、结果
1.形态学特点：细胞直径约为10 μm，贴壁后为单层铺砖样结构，显示上皮细胞生长特点。Giemsa染色可见细胞呈多角形，核为卵圆形，核仁小而清楚，胞浆较少，其内见细小颗粒(图1)。至今，该细胞已培养至98代，但细胞形态和免疫组化没有发生明显的变化。
图1 大鼠肝卵圆细胞的相差显微形态，细胞小，多角形，核为卵圆形，可见清楚的核仁，胞浆较少，细胞为单层辅砖样结构，显示上皮细胞生长特点 ×200
2.免疫组化及组化染色结果：所分离的细胞呈γ-GT阳性；细胞角蛋白8阳性；细胞角蛋白19阳性；波形蛋白部分阳性；AFP部分阳性；LCA阴性。
3.电镜观察：所分离的细胞在电镜下表现为细胞核/浆较大，细胞表面可见少量短而小的微绒毛状突起；胞浆内细胞器少，仅见小的线粒体和少量内浆网，呈幼稚、未分化细胞之形态特点(图2)。
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图2 大鼠肝卵圆细胞的超微结构形态，细胞核/浆较大，核仁明显，胞浆内细胞器少，仅见小的线粒体和少量内浆网，细胞表面可见少量短而小的微绒毛状突起，呈未分化细胞之形态特点 ×9090
三、讨论
卵圆细胞在形态及超微结构上相似于胆管上皮细胞，但在酶化学、免疫组织化学、生物化学及分子生物学等方面同时兼备胆管上皮细胞和肝细胞的许多表型特点[2，3]，如呈现γ-GT、细胞角蛋白8、19等胆管上皮细胞的标志物阳性，同时亦显示G-6-P酶、AFP、白蛋白等肝细胞标志物阳性。体外培养卵圆细胞及胚胎肝细胞均可分化成肝细胞和胆管上皮细胞[4]。由致癌剂或癌基因诱导卵圆细胞转化后可形成肝细胞癌、胆管上皮癌和未分化癌[5，6]。这些结果均提示，由化学致癌剂诱导增生的卵圆细胞是一种癌前细胞，与肝癌的发生有密切的关系。因此，弄清卵圆细胞的来源、性质及其生物学特性是肝癌发生学研究中一项极为重要的工作。我们采用Percoll密度梯度离心法，成功地分离出了由化学致癌剂3′-Me-DAB诱发增生的大鼠肝卵圆细胞，并对其进行了长期的体外培养。电镜显示所分离出的细胞胞浆较少，胞浆内细胞器少，表现为原始幼稚未分化细胞的超微结构特点；免疫组化染色这些细胞显示细胞角蛋白8、19阳性，AFP、波形蛋白部分阳性、组化染色γ-GT阳性，这些均与卵圆细胞的“双相”表型符合；同时，这些细胞LCA阴性，说明其不是淋巴细胞。这些结果表明，本实验所分离出的细胞是卵圆细胞，为进一步研究肝癌发生学打下了基础。
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作者单位：510089 广州，中山医科大学病理学教研室
参考文献
1 Germain L, No
l M, Gourdeau H, et al. Promotion of growth and differentiation of rat ductular oval cells in primary culture. Cancer Res, 1988,48：368-378.
2 Alison M, Golding M, Lalani EN, et al. Wholesale hepatocytic differentiation in the rat from ductular oval cells, the progeny of biliary stem cells. J Hepatol, 1997,26：343-352.
, 百拇医药
3 Golding M, Sarraf CE, Lalani EN, et al. Oval cell differentiation into hepatocytes in the acetylaminofluorene-treated regenerating rat liver. Hepatology, 1995,22(4 Pt 1)：1243-1253.
4 Tian YW, Smith PG, Yeoh GC. The oval-shaped cell as a candidate for a liver stem cell in embryonic, neonatal and precancerous liver: identification based on morphology and immunohistochemical staining for albumin and pyruvate kinase isoenzyme expression. Histochem Cell Biol, 1997,107：243-250.
, 百拇医药
5 Becker R, Luthgens B, Oesch F, et al. Ha-ras Val 12 but not p53 Ser247 leads to a significant neoplastic transformation rate of the putative rat liver stem cells (oval cell). Carcinogenesis, 1996,17：2635-2640.
6 Steinberg P, Steinbrecher R, Radaeva S, et al. Oval cell lines OC/CDE 6 and OC/CDE 22 give rise to cholangio-cellular and undifferentiated carcinomas after transformation. Lab Invest, 1994,71：700-709.
(收稿：1997-02-05 修回：1997-09-22), 百拇医药
单位：510089 广州，中山医科大学病理学教研室
关键词：
中华病理学杂志980227 卵圆细胞(oval cell)是肝内的干细胞，在原发性肝癌的发生中可能具有特殊作用，故分离并体外培养之，使之成为细胞癌变多步骤发生发展的体外模型，对研究肝癌的组织起源具有重要意义。
一、材料与方法
1.卵圆细胞增生动物模型的建立：由我校实验动物中心提供标准SD大鼠，体重100～120 g，饲养1周后，改喂含有0.06%3′-甲基-二甲胺基偶氮苯(3′-Me-DAB，东京化成工业株式会社)的饲料，4周后大鼠肝内可见大量卵圆细胞增生(由HE切片证实)。
2.卵圆细胞的分离：取饲喂含3′-Me-DAB饲料4周的大鼠，麻醉后剪开腹壁，结扎肝动脉，插管于门静脉，用无钙镁磷酸缓冲液灌注大鼠肝(循环泵的灌注速度为20 ml/分钟)至苍白色后，改用0.1% Ⅳ型胶原酶(Sigma公司产品)继续灌注。10分钟后，将肝脏剪碎，置0.06%Ⅳ型胶原酶溶液中，37℃振荡消化30分钟，过滤，4℃ 2 000 r/min离心10分钟，倾去上清液，用F12培养液悬浮细胞。将Percoll(Pharmacia公司产品)配成50%、70%、90%的梯度离心液，从离心管底部开始逐层铺加，细胞悬液置于最上层，4℃ 12 000 r/min离心30分钟。小心吸取卵圆细胞层(位于50%和70%的Percoll层之间)，用Hanks液洗细胞两次后离心，将细胞团悬浮于培养液中，接种于塑料培养瓶(Corning公司)，在37℃、5% CO2孵箱中培养，第二天可见卵圆细胞在瓶底贴壁生长。
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3.卵圆细胞的培养：培养液参照Germain[1]的方法配制。培养基为DMEM/F12(1∶1)和20%小牛血清，加入表皮生长因子、转铁蛋白及多种氨基酸(Sigma公司)。将卵圆细胞进行常规培养，每2天换液一次，细胞长满后传代。
4.卵圆细胞性质的鉴定：(1)细胞大小的测定及HE形态观察。(2)免疫组化：用Cytospin仪将细胞涂于载玻片上，冷丙酮固定，免疫组化检测采用LSAB法。检测抗体有：细胞角蛋白8(1∶100)，细胞角蛋白19(1∶100)，白细胞共同抗原(LCA，1∶100)，波形蛋白(1∶100)，甲胎蛋白(AFP)(1∶200)，均为DAKO 公司产品。(3)透射电镜：收集培养细胞，于4℃下用多聚甲醛-戊二醛(pH 7.3)固定4小时，锇酸固定1小时，系列酒精及丙酮脱水，Epon 812渗透包埋，超薄切片；醋酸双氢铀及枸橼酸铅双重染色。H-600型电镜75 KV观察拍片。(4)γ-谷氨酰转肽酶(γ-GT)组织化学：将细胞接种于玻片上，待细胞贴壁后用冷丙酮固定。以V-L-谷氨酰-2-萘胺作底物，六偶氮副品红作偶联剂，以正常肾组织作阳性对照。
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二、结果
1.形态学特点：细胞直径约为10 μm，贴壁后为单层铺砖样结构，显示上皮细胞生长特点。Giemsa染色可见细胞呈多角形，核为卵圆形，核仁小而清楚，胞浆较少，其内见细小颗粒(图1)。至今，该细胞已培养至98代，但细胞形态和免疫组化没有发生明显的变化。
图1 大鼠肝卵圆细胞的相差显微形态，细胞小，多角形，核为卵圆形，可见清楚的核仁，胞浆较少，细胞为单层辅砖样结构，显示上皮细胞生长特点 ×200
2.免疫组化及组化染色结果：所分离的细胞呈γ-GT阳性；细胞角蛋白8阳性；细胞角蛋白19阳性；波形蛋白部分阳性；AFP部分阳性；LCA阴性。
3.电镜观察：所分离的细胞在电镜下表现为细胞核/浆较大，细胞表面可见少量短而小的微绒毛状突起；胞浆内细胞器少，仅见小的线粒体和少量内浆网，呈幼稚、未分化细胞之形态特点(图2)。
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图2 大鼠肝卵圆细胞的超微结构形态，细胞核/浆较大，核仁明显，胞浆内细胞器少，仅见小的线粒体和少量内浆网，细胞表面可见少量短而小的微绒毛状突起，呈未分化细胞之形态特点 ×9090
三、讨论
卵圆细胞在形态及超微结构上相似于胆管上皮细胞，但在酶化学、免疫组织化学、生物化学及分子生物学等方面同时兼备胆管上皮细胞和肝细胞的许多表型特点[2，3]，如呈现γ-GT、细胞角蛋白8、19等胆管上皮细胞的标志物阳性，同时亦显示G-6-P酶、AFP、白蛋白等肝细胞标志物阳性。体外培养卵圆细胞及胚胎肝细胞均可分化成肝细胞和胆管上皮细胞[4]。由致癌剂或癌基因诱导卵圆细胞转化后可形成肝细胞癌、胆管上皮癌和未分化癌[5，6]。这些结果均提示，由化学致癌剂诱导增生的卵圆细胞是一种癌前细胞，与肝癌的发生有密切的关系。因此，弄清卵圆细胞的来源、性质及其生物学特性是肝癌发生学研究中一项极为重要的工作。我们采用Percoll密度梯度离心法，成功地分离出了由化学致癌剂3′-Me-DAB诱发增生的大鼠肝卵圆细胞，并对其进行了长期的体外培养。电镜显示所分离出的细胞胞浆较少，胞浆内细胞器少，表现为原始幼稚未分化细胞的超微结构特点；免疫组化染色这些细胞显示细胞角蛋白8、19阳性，AFP、波形蛋白部分阳性、组化染色γ-GT阳性，这些均与卵圆细胞的“双相”表型符合；同时，这些细胞LCA阴性，说明其不是淋巴细胞。这些结果表明，本实验所分离出的细胞是卵圆细胞，为进一步研究肝癌发生学打下了基础。
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作者单位：510089 广州，中山医科大学病理学教研室
参考文献
1 Germain L, No
l M, Gourdeau H, et al. Promotion of growth and differentiation of rat ductular oval cells in primary culture. Cancer Res, 1988,48：368-378.2 Alison M, Golding M, Lalani EN, et al. Wholesale hepatocytic differentiation in the rat from ductular oval cells, the progeny of biliary stem cells. J Hepatol, 1997,26：343-352.
, 百拇医药
3 Golding M, Sarraf CE, Lalani EN, et al. Oval cell differentiation into hepatocytes in the acetylaminofluorene-treated regenerating rat liver. Hepatology, 1995,22(4 Pt 1)：1243-1253.
4 Tian YW, Smith PG, Yeoh GC. The oval-shaped cell as a candidate for a liver stem cell in embryonic, neonatal and precancerous liver: identification based on morphology and immunohistochemical staining for albumin and pyruvate kinase isoenzyme expression. Histochem Cell Biol, 1997,107：243-250.
, 百拇医药
5 Becker R, Luthgens B, Oesch F, et al. Ha-ras Val 12 but not p53 Ser247 leads to a significant neoplastic transformation rate of the putative rat liver stem cells (oval cell). Carcinogenesis, 1996,17：2635-2640.
6 Steinberg P, Steinbrecher R, Radaeva S, et al. Oval cell lines OC/CDE 6 and OC/CDE 22 give rise to cholangio-cellular and undifferentiated carcinomas after transformation. Lab Invest, 1994,71：700-709.
(收稿：1997-02-05 修回：1997-09-22), 百拇医药